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Anlage 35 NACHWEIS UND BESTIMMUNG VON HEXAMIDEN, DIBROMHEXAMIDIN, DIBROMPROPAMIDIN UND CHLORHEXIDIN

1. 1.Ziffer eins
   Zweck und Anwendungsbereich

   Diese Methode beschreibt ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von

   • –Strichaufzählung
     Hexamidin und dessen Salzen einschließlich Isethionat und p-Hydroxybenzoat,
   • –Strichaufzählung
     Dibromhexamidin und dessen Salzen einschließlich Isethionat,
   • –Strichaufzählung
     Dibrompropamidin und dessen Salzen einschließlich Isethionat,
   • –Strichaufzählung
     Chlorhexidindiacetat, -digluconat und -dihydrochlorid

   in kosmetischen Erzeugnissen.
2. 2.Ziffer 2
   Definition

   Der nach diesem Verfahren ermittelte Gehalt an Hexamidin, Dibromhexamidin, Dibrompropamidin und Chlorhexidin wird in Massenprozent (% m/m) des Erzeugnisses angegeben.
3. 3.Ziffer 3
   Kurzbeschreibung

   Die qualitative und quantitative Bestimmung erfolgt mit Hilfe der Ionenpaar-HPLC mit reverser Phase und nachfolgender UV-Spektrophotometrie. Hexamidin, Dibromhexamidin, Dibrompropamidin und Chlorhexidin werden über ihre Retentionszeit nachgewiesen.
4. 4.Ziffer 4
   Reagenzien

   Alle Reagenzien müssen analysenrein und, wo erforderlich, für die HPLC geeignet sein.
5. 4.1.4 Punkt eins
   Methanol.
6. 4.2.4 Punkt 2
   Natriumsalz der 1-Heptansulfonsäure, Monohydrat.
7. 4.3.4 Punkt 3
   Essigsäure (Eisessig, d20 = 1,05 g/ml).
8. 4.4.4 Punkt 4
   Natriumchlorid.
9. 4.5.4 Punkt 5
   Fließmittel (Mobile Phase).
10. 4.5.1.4 Punkt 5 Punkt eins
    Eluent I: 0,005 M Lösung des Natriumsalzes der 1-Heptansulfonsäure (4.2) in Methanol (4.1), mit Essigsäure (4.3) auf einen scheinbaren pH-Wert von 3,5 eingestellt.
11. 4.5.2.4 Punkt 5 Punkt 2
    Eluent II: 0,005 M wäßrige Lösung des Natriumsalzes der 1-Heptansulfonsäure (4.2), mit Essigsäure (4.3) auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt.

• –Strichaufzählung
  Eluent I: 5,84 g Natriumchlorid (4.4) und 1,1013 g des Natriumsalzes der 1-Heptansulfonsäure (4.2) werden in 100 ml Wasser gelöst. Nach Zusatz von 900 ml Methanol (4.1) wird die Mischung mit Essigsäure (4.3) auf einen scheinbaren pH-Wert von 3,5 eingestellt.
• –Strichaufzählung
  Eluent II: 5,84 g Natriumchlorid (4.4) und 1,1013 g des Natriumsalzes der 1-Heptansulfonsäure (4.2) werden in 1 Liter Wasser gelöst und mit Essigsäure (4.3) auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt.

1. 4.6.4 Punkt 6
   Hexamidindiisethionat [C20H26N4O22C2H6O4S].
2. 4.7.4 Punkt 7
   Dibromhexamidindiisethionat [C20H24Br2N4O22C2H6O4S].
3. 4.8.4 Punkt 8
   Dibrompropamidindiisethionat [C17H18Br2N4O22C2H6O4S].
4. 4.9.4 Punkt 9
   Chlorhexidindiacetat [C22H30Cl2N102C2H4O2].
5. 4.10.4 Punkt 10
   Referenzlösungen: 0,05%ige (m/v) Lösungen von jedem der vier Konservierungsmittel (4.6 bis 4.9) in Eluent I (4.5.1).Referenzlösungen: 0,05%ige (m/v) Lösungen von jedem der vier Konservierungsmittel (4.6 bis 4.9) in Eluent römisch eins (4.5.1).
6. 4.11.4 Punkt 11
   3,4,4'-Trichlor-carbanilid (Triclocarban).
7. 4.12.4 Punkt 12
   4,4'-Dichlor-3-trifluormethyl-carbanilid (Halocarban).
8. 5.Ziffer 5
   Geräte
9. 5.1.5 Punkt eins
   Normale Laborausstattung.
10. 5.2.5 Punkt 2
    Hochleistungsflüssigkeitschromatograph mit UV-Detektor mit variabler Wellenlänge.
11. 5.3.5 Punkt 3
    Analytische Trennsäule.

    Material: Edelstahl,

    Länge: 30 cm,

    Innendurchmesser: 4 mm,

    Aktiver Festkörper: -Bondapak C18, 10 m, oder gleichwertiges Erzeugnis.
12. 5.4.5 Punkt 4
    Ultraschallbad.
13. 6.Ziffer 6
    Nachweis
14. 6.1.6 Punkt eins
    Vorbereitung der Probe

    Ungefähr 0,5 g Probe werden in einen 10-ml-Meßkolben eingewogen und mit Eluent I (4.5.1) zur Marke aufgefüllt. Der Meßkolben wird 10 Minuten lang in ein Ultraschallbad (5.4) gestellt. Die Mischung wird anschließend zentrifugiert oder durch ein Faltenfilter filtriert. Die überstehende Flüssigkeit bzw. das Filtrat wird für den Nachweis verwendet.Ungefähr 0,5 g Probe werden in einen 10-ml-Meßkolben eingewogen und mit Eluent römisch eins (4.5.1) zur Marke aufgefüllt. Der Meßkolben wird 10 Minuten lang in ein Ultraschallbad (5.4) gestellt. Die Mischung wird anschließend zentrifugiert oder durch ein Faltenfilter filtriert. Die überstehende Flüssigkeit bzw. das Filtrat wird für den Nachweis verwendet.
15. 6.2.6 Punkt 2
    Chromatographie
16. 6.2.1.6 Punkt 2 Punkt eins
    Gradientenprogramm:

1. 6.2.2.6 Punkt 2 Punkt 2
   Volumenstrom der mobilen Phase (6.2.1): 1,5 ml/min, Säulentemperatur: 35 °C.
2. 6.2.3.6 Punkt 2 Punkt 3
   Detektionswellenlänge: 264 nm.
3. 6.2.4.6 Punkt 2 Punkt 4
   10 l jeder Referenzlösung (4.10) werden injiziert und die Chromatogramme aufgezeichnet.
4. 6.2.5.6 Punkt 2 Punkt 5
   10 l der Probelösung (6.1) werden injiziert und das Chromatogramm aufgezeichnet.
5. 6.3.6 Punkt 3
   Durch Vergleich der Retentionszeiten der nach 6.2.5 aufgezeichneten Peaks mit den nach 6.2.4 ermittelten Retentionszeiten wird das Vorhandensein von Hexamidin, Dibromhexamidin, Dibrompropamidin bzw. Chlorhexidin nachgewiesen.
6. 7.Ziffer 7
   Bestimmung
7. 7.1.7 Punkt eins
   Herstellung der Standardlösungen

   Als innerer Standard wird eines der Konservierungsmittel (4.6 bis 4.9), das in der Probe nicht vorhanden ist, verwendet. Ist dies nicht möglich, kann Triclocarban (4.11) oder Halocarban (4.12) verwendet werden.
8. 7.1.1.7 Punkt eins Punkt eins
   0,05%ige (m/v) Stammlösung des nach 6.3 identifizierten Konservierungsmittels in Eluent I (4.5.1).0,05%ige (m/v) Stammlösung des nach 6.3 identifizierten Konservierungsmittels in Eluent römisch eins (4.5.1).
9. 7.1.2.7 Punkt eins Punkt 2
   0,05%ige (m/v) Stammlösung des als inneren Standard gewählten Konservierungsmittels in Eluent I (4.5.1).0,05%ige (m/v) Stammlösung des als inneren Standard gewählten Konservierungsmittels in Eluent römisch eins (4.5.1).
10. 7.1.3.7 Punkt eins Punkt 3
    Gemäß nachstehender Tabelle werden für jedes identifizierte Konservierungsmittel vier Standardlösungen hergestellt, indem die entsprechenden Volumina der Stammlösung des identifizierten Konservierungsmittels (7.1.1) und der Stammlösung des inneren Standards (7.1.2) in eine Serie von 10-ml-Meßkolben pipettiert und mit Eluent I (4.5.1) bis zur Marke aufgefüllt und gemischt werden.Gemäß nachstehender Tabelle werden für jedes identifizierte Konservierungsmittel vier Standardlösungen hergestellt, indem die entsprechenden Volumina der Stammlösung des identifizierten Konservierungsmittels (7.1.1) und der Stammlösung des inneren Standards (7.1.2) in eine Serie von 10-ml-Meßkolben pipettiert und mit Eluent römisch eins (4.5.1) bis zur Marke aufgefüllt und gemischt werden.

1. 7.2.7 Punkt 2
   Vorbereitung der Probe
2. 7.2.1.7 Punkt 2 Punkt eins
   Ungefähr 0,5 g der Probe (p Gramm) werden in einen 10-ml-Meßkolben genau eingewogen, mit 1,0 ml der Lösung des inneren Standards (7.1.2) und 6 ml Eluent I (4.5.1) versetzt und gemischt.Ungefähr 0,5 g der Probe (p Gramm) werden in einen 10-ml-Meßkolben genau eingewogen, mit 1,0 ml der Lösung des inneren Standards (7.1.2) und 6 ml Eluent römisch eins (4.5.1) versetzt und gemischt.
3. 7.2.2.7 Punkt 2 Punkt 2
   Die Mischung wird 10 Minuten in ein Ultraschallbad (5.4) gestellt und nach dem Abkühlen mit dem Eluenten I (4.5.1) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Die Mischung wird anschließend zentrifugiert oder durch ein Faltenfilter filtriert. Die überstehende Flüssigkeit bzw. das Filtrat wird chromatographiert.Die Mischung wird 10 Minuten in ein Ultraschallbad (5.4) gestellt und nach dem Abkühlen mit dem Eluenten römisch eins (4.5.1) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Die Mischung wird anschließend zentrifugiert oder durch ein Faltenfilter filtriert. Die überstehende Flüssigkeit bzw. das Filtrat wird chromatographiert.
4. 7.3.7 Punkt 3
   Chromatographie
5. 7.3.1.7 Punkt 3 Punkt eins
   Der Gradient und der Volumenstrom der mobilen Phase, die Säulentemperatur und die Detektionswellenlänge werden entsprechend den Bedingungen für den Nachweis (6.2.1 bis 6.2.3) eingestellt.
6. 7.3.2.7 Punkt 3 Punkt 2
   10 l der Probelösung (7.2.2) werden chromatographiert, die Peakflächen gemessen und das Verhältnis zwischen der Peakfläche des zu bestimmenden Konservierungsmittels und der Peakfläche des inneren Standards ermittelt. Die Wiederholbarkeit des Meßsignals wird durch wiederholtes Chromatographieren überprüft.
7. 7.4.7 Punkt 4
   Eichung
8. 7.4.1.7 Punkt 4 Punkt eins
   10 l jeder der vier Standardlösungen (7.1.3) werden chromatographiert und die Peakflächen gemessen.
9. 7.4.2.7 Punkt 4 Punkt 2
   Für jede Standardlösung (7.1.3) wird das Verhältnis zwischen der Peakfläche des Hexamidins, des Dibromhexamidins, des Dibrompropamidins bzw. des Chlorhexidins und der Peakfläche des inneren Standards ermittelt.

   Es wird eine Eichkurve gezeichnet, indem die Peakflächenverhältnisse als Ordinate und die entsprechenden Konzentrationen des zu bestimmenden Konservierungsmittels in der Standardlösung in Mikrogramm je Milliliter als Abszisse aufgetragen werden.
10. 7.4.3.7 Punkt 4 Punkt 3
    Aus der Eichkurve (7.4.2) wird die Konzentration des zu bestimmenden Konservierungsmittels abgelesen, die dem nach 7.3.2 ermittelten Peakflächenverhältnis entspricht.
11. 8.Ziffer 8
    Berechnung

    Der Gehalt an Hexamidin, Dibromhexamidin, Dibrompropamidin oder Chlorhexidin in Massenprozent (% m/m) der Probe wird nach folgender Formel berechnet:

1. 9.Ziffer 9
   Wiederholbarkeit (1)

   Bei einem Gehalt an Hexamidin, Dibromhexamidin, Dibrompropamidin oder Chlorhexidin von 0,1% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,005% (m/m) voneinander abweichen.
2. 10.Ziffer 10
   Molmassen

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(1) ISO 5725.