Text

Anlage 36 NACHWEIS UND BESTIMMUNG VON BENZOESÄURE, 4-HYDROXYBENZOESÄURE, SORBINSÄURE, SALICYLSÄURE UND PROPIONSÄURE IN KOSMETISCHEN MITTELN

1. 1.Ziffer eins
   Zweck und Anwendungsbereich

   Diese Methode beschreibt ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Benzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Sorbinsäure, Salicylsäure und Propionsäure in kosmetischen Mitteln. Die Methode gliedert sich in Verfahren

   • –Strichaufzählung
     zum Nachweis dieser Konservierungsstoffe,
   • –Strichaufzählung
     zur Bestimmung von Benzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Sorbinsäure und Salicylsäure,
   • –Strichaufzählung
     zur Bestimmung von Propionsäure.
2. 2.Ziffer 2
   Definition

   Der nach diesen Verfahren ermittelte Gehalt an Benzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Sorbinsäure, Salicylsäure und Propionsäure wird in Prozent (% m/m) an freier Säure angegeben.
3. A.A
   NACHWEIS
4. 1.Ziffer eins
   Kurzbeschreibung

   Im Anschluß an eine Säure/Base-Extraktion der Konservierungsstoffe wird der Extrakt mittels DC und Reaktionschromatographie („On-plate-Derivatisierung“) analysiert. In Abhängigkeit vom Ergebnis erfolgt eine Bestätigung des Nachweises durch HPLC oder, im Fall von Propionsäure, durch GC.
5. 2.Ziffer 2
   Reagenzien
6. 2.1.2 Punkt eins
   Alle Reagenzien müssen analysenrein sein. Wasser muß destilliert sein oder zumindest gleichwertige Reinheit aufweisen.
7. 2.2.2 Punkt 2
   Aceton
8. 2.3.2 Punkt 3
   Diethylether
9. 2.4.2 Punkt 4
   Acetonitril
10. 2.5.2 Punkt 5
    Toluen
11. 2.6.2 Punkt 6
    n-Hexan
12. 2.7.2 Punkt 7
    Flüssiges Paraffin
13. 2.8.2 Punkt 8
    Salzsäure, 4 M
14. 2.9.2 Punkt 9
    Kalilauge, 4 M
15. 2.10.2 Punkt 10
    Calciumchlorid, CaCl2 2 H2O
16. 2.11.2 Punkt 11
    Lithiumcarbonat, Li2CO3
17. 2.12.2 Punkt 12
    2-Brom-2'-acetonaphthon
18. 2.13.2 Punkt 13
    4-Hydroxybenzoesäure
19. 2.14.2 Punkt 14
    Salicylsäure
20. 2.15.2 Punkt 15
    Benzoesäure
21. 2.16.2 Punkt 16
    Sorbinsäure
22. 2.17.2 Punkt 17
    Propionsäure
23. 2.18.2 Punkt 18
    Vergleichslösungen

    Jeweils 0,1%ige (m/V) Lösungen (100 mg/100 ml) der fünf Konservierungsstoffe (2.13 bis 2.17) im Diethylether.
24. 2.19.2 Punkt 19
    Derivatisierungsreagenz

    0,5%ige (m/V) Lösung von 2-Brom-2'-acetonaphthon (2.12) in Acetonitril (2.4). Die Lösung muß wöchentlich frisch hergestellt und im Kühlschrank aufbewahrt werden.
25. 2.20.2 Punkt 20
    Katalysator-Lösung

    0,3%ige (m/V) Lösung von Lithiumcarbonat (2.11) in Wasser (300 mg/100 ml). Diese Lösung muß frisch hergestellt werden.
26. 2.21.2 Punkt 21
    Fließmittel

    Toluen (2.5)/Aceton (2.2), 20 + 0,5 (V + V)Toluen (2.5)/Aceton (2.2), 20 + 0,5 (römisch fünf + römisch fünf)
27. 2.22.2 Punkt 22
    Tauch-Lösung

    Flüssiges Paraffin (2.7)/n-Hexan (2.6), 1 + 2 (V + V)Flüssiges Paraffin (2.7)/n-Hexan (2.6), 1 + 2 (römisch fünf + römisch fünf)
28. 3.Ziffer 3
    Geräte

    Normale Laborausstattung und
29. 3.1.3 Punkt eins
    Wasserbad, auf 60 °C konstant einstellbar
30. 3.2.3 Punkt 2
    Chromatographiekammer
31. 3.3.3 Punkt 3
    UV-Lampe, 254 und 366 nm
32. 3.4.3 Punkt 4
    DC-Fertigplatten (200 mm x 200 mm)

    Sorbensschicht: Kieselgel 60 ohne Fluoreszenzindikator

    Schichtdicke: 0,25 mm mit Konzentrierungszone 25 mm x 200 mm (Merck 11845 oder gleichwertiges Erzeugnis)
33. 3.5.3 Punkt 5
    Mikroliterspritze, 10 l
34. 3.6.3 Punkt 6
    Mikroliterspritze, 25 l
35. 3.7.3 Punkt 7
    Trockenschrank, bis auf 105 °C konstant einstellbar
36. 3.8.3 Punkt 8
    Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen, 50 ml und 200 ml
37. 3.9.3 Punkt 9
    Papierfilter, Durchmesser 90 mm (Schleicher und Schüll, Weißband Nr. 5892, oder gleichwertiges Erzeugnis)
38. 3.10.3 Punkt 10
    Universal pH-Indikatorpapier, pH 1-11
39. 3.11.3 Punkt 11
    Probenfläschchen, 5 ml
40. 3.12.3 Punkt 12
    Rotationsverdampfer
41. 3.13.3 Punkt 13
    Heizplatte
42. 4.Ziffer 4
    Durchführung
43. 4.1.4 Punkt eins
    Vorbereitung der Probe

    Ungefähr 1,0 g der Probe wird in einen 50-ml-Erlenmeyerkolben (3.8) mit 4 Tropfen 4 M Salzsäure (2.8) und 40 ml Aceton (2.2) versetzt.

    Bei stark basischen Erzeugnissen, wie Feinseife, werden 20 Tropfen 4 M Salzsäure (2.8) hinzugefügt. Der mit Indikatorpapier (3.10) gemessene pH-Wert soll ungefähr 2 betragen.

    Der Erlenmeyerkolben wird verschlossen und eine Minute lang kräftig geschüttelt. Notfalls kann die Mischung vorsichtig bis auf 60 °C erwärmt werden, damit die Fettphase schmilzt und die Extraktion der Konservierungsstoffe in die Aceton-Phase erleichtert wird.

    Die Mischung wird auf Zimmertemperatur abgekühlt und durch ein Papierfilter (3.9) filtriert. 20 ml des Filtrats werden in einen 200-ml-Erlenmeyerkolben übergeführt, mit 20 ml Wasser versetzt und gemischt. Mit 4 M Kalilauge (2.9) wird der pH-Wert der Mischung gegen Idikatorpapier (3.10) auf ungefähr 10 eingestellt.

    Nach Zusatz von 1 g Calciumchlorid (2.10) wird die Mischung kräftig geschüttelt und danach durch ein Papierfilter (3.9) in einen 250-ml-Scheidetrichter, der 75 ml Diethylether (2.3) enthält, filtriert. Die Mischung wird eine Minute lang kräftig geschüttelt. Nach der Phasentrennung wird die wäßrige Phase in einen weiteren 250-ml-Scheidetrichter abgelassen und die Etherphase verworfen. Mit Hilfe von Indikatorpapier (3.10) wird der pH-Wert der wäßrigen Lösung mit 4 M Salzsäure (2.8) auf ungefähr 2 eingestellt. Nach Zusatz von 10 ml Diethylether (2.3) wird die Mischung eine Minute lang kräftig geschüttelt. Nach der Phasentrennung wird die Etherphase in einen Rotationsverdampfer (3.12) übergeführt und die wäßrige Phase verworfen.

    Die Etherphase wird fast zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 1 ml Diethylether (2.3) aufgenommen. Diese Lösung wird in ein Probenfläschchen (3.11) übergeführt.
44. 4.2.4 Punkt 2
    Dünnschichtchromatographie

    Entsprechend der Anzahl der zu chromatographierenden Vergleichs- und Probelösungen werden auf die Startlinie in der Konzentrierungszone der Dünnschichtplatte in gleichen Abständen je 3 l Lithiumcarbonatlösung (2.20) mit einer Mikroliterspritze (3.5) aufgetragen. Die Dünnschichtplatte wird im Kaltluftstrom getrocknet und anschließend auf eine 40 °C warme Heizplatte (3.13) gelegt, damit beim nachfolgenden Auftragen der Lösungen die Flecke möglichst klein bleiben. Mit einer Mikroliterspritze (3.5) werden von jeder Vergleichslösung (2.18) und von der Probelösung (4.1) jeweils 10 l exakt auf die Startflecke des Lithiumcarbonats aufgetragen. Schließlich werden mit der Mikroliterspritze (3.6) exakt auf diese Startflecke jeweils etwa 15 l Derivatisierungsreagenz (2.19) aufgetragen.

    Die Dünnschichtplatte wird im Trockenschrank (3.7) 45 Minuten lang bei 80 °C erwärmt. Nach dem Abkühlen wird die Dünnschichtplatte in die vorher für 15 Minuten mit dem Fließmittel (2.21) äquilibrierte Chromatographiekammer (3.2) (ohne Filterpapier) gestellt und bis zu einer Höhe von 15 cm entwickelt (Zeitdauer etwa 80 Minuten).

    Die Dünnschichtplatte wird im Kaltluftstrom getrocknet und im UV-Licht (3.3) betrachtet. Die Fluoreszenz der schwachen Flecke kann durch Tauchen der Dünnschichtplatte in flüssiges Paraffin/n-Hexan (2.22) verstärkt werden.
45. 5.Ziffer 5
    Auswertung

    Der Rf-Wert wird für jeden Fleck berechnet. Die für die Probelösung erhaltenen Flecke werden mit denen der Vergleichslösungen im Hinblick auf ihre Rf-Werte und ihr Verhalten im UV-Licht verglichen.

    Im Ergebnis dieses Vergleichs wird eine vorläufige Schlußfolgerung gezogen, ob und welche Konservierungsstoffe vorliegen.

    Man führt die im folgenden Abschnitt B beschriebene HPLC oder, im Fall der Propionsäure, die im Abschnitt C beschriebene GC durch und vergleicht die Retentionszeiten der Probenpeaks mit denen der Vergleichslösungen. Der Nachweis der Konservierungsstoffe wird abschließend durch Kombination der Ergebnisse der DC und der HPLC bzw. GC geführt.
46. B.B
    BESTIMMUNG VON BENZOESÄURE, 4-HYDROXYBENZOESÄURE, SORBINSÄURE UND SALICYLSÄURE
47. 1.Ziffer eins
    Kurzbeschreibung

    Nach dem Ansäuern wird die Probe mit einer Mischung aus Ethanol und Wasser extrahiert. Nach der Filtration wird der Gehalt an Konservierungsstoffen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt.
48. 2.Ziffer 2
    Reagenzien
49. 2.1.2 Punkt eins
    Alle Reagenzien müssen analysenrein und, wo erforderlich, für die HPLC geeignet sein. Wasser muß destilliert sein oder zumindest gleichwertige Reinheit aufweisen.
50. 2.2.2 Punkt 2
    Absolutes Ethanol
51. 2.3.2 Punkt 3
    4-Hydroxybenzoesäure
52. 2.4.2 Punkt 4
    Salicylsäure
53. 2.5.2 Punkt 5
    Benzoesäure
54. 2.6.2 Punkt 6
    Sorbinsäure
55. 2.7.2 Punkt 7
    Natriumacetat, CH3COONa 3H2O
56. 2.8.2 Punkt 8
    Essigsäure,

              d = 1,05 g/ml

1. 2.9.2 Punkt 9
   Acetonitril
2. 2.10.2 Punkt 10
   Schwefelsäure, 2 M
3. 2.11.2 Punkt 11
   Kalilauge, 0,2 M
4. 2.12.2 Punkt 12
   2-Methoxybenzoesäure
5. 2.13.2 Punkt 13
   Ethanol/Wasser-Mischung

   9 Volumenteile Ethanol (2.2) werden mit 1 Volumenteil Wasser (2.1) gemischt.
6. 2.14.2 Punkt 14
   Lösung des inneren Standards

   Ungefähr 1 g 2-Methoxybenzoesäure (2.12) wird in 500 ml Ethanol/Wasser-Mischung (2.13) gelöst.
7. 2.15.2 Punkt 15
   Mobile Phase
8. 2.15.1.2 Punkt 15 Punkt eins
   Acetatpuffer: 6,35 g Natriumacetat (2.7) und 20,0 ml Essigsäure (2.8) werden in 1 l Wasser gelöst.
9. 2.15.2.2 Punkt 15 Punkt 2
   Mobile Phase: 9 Volumenteile Acetatpuffer (2.15.1) und 1 Volumenteil Acetonitril (2.9) werden gemischt.
10. 2.16.2 Punkt 16
    Stammlösung der Konservierungsstoffe

    Ungefähr 0,05 g 4-Hydroxybenzoesäure (2.3), 0,2 g Salicylsäure (2.4), 0,2 g Benzoesäure (2.5) und 0,05 g Sorbinsäure (2.6) werden in einen 50-ml-Meßkolben genau eingewogen und mit der Ethanol/Wasser-Mischung (2.13) zur Marke aufgefüllt. Die Lösung wird im Kühlschrank aufbewahrt und ist eine Woche lang haltbar.
11. 2.17.2 Punkt 17
    Standardlösungen der Konservierungsstoffe

    Von der Stammlösung (2.16) werden 8,00, 4,00, 2,00, 1,00 bzw. 0,50 ml in eine Reihe von 20-ml-Meßkolben pipettiert. Nach Zusatz von jeweils 10,00 ml der Lösung des inneren Standards (2.14) mittels Pipette und 0,5 ml 2 M Schwefelsäure (2.10) wird mit der Ethanol/Wasser-Mischung (2.13) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Die Lösungen sind frisch herzustellen.
12. 3.Ziffer 3
    Geräte

    Normale Laborausstattung und
13. 3.1.3 Punkt eins
    Wasserbad, auf 60 °C konstant einstellbar
14. 3.2.3 Punkt 2
    Hochleistungsflüssigkeitschromatograph mit UV-Detektor mit variabler Wellenlänge und mit 10 l-Probenschleife
15. 3.3.3 Punkt 3
    Analytische Trennsäule

    Material: Edelstahl

    Länge: 12,5 bis 25 cm

    Innendurchmesser: 4,6 mm

    Aktiver Festkörper: Mit Octadecylgruppen modifiziertes Kieselgel (Nucleosil 5 C18 oder gleichwertiges Erzeugnis)
16. 3.4.3 Punkt 4
    Papierfilter, Durchmesser 90 mm (Schleicher und Schüll, Weißband Nr. 5892, oder gleichwertiges Erzeugnis)
17. 3.5.3 Punkt 5
    Erlenmeyerkolben, 50 ml
18. 3.6.3 Punkt 6
    Probenfläschchen, 5 ml
19. 3.7.3 Punkt 7
    Siedesteinchen (Karborund), Größe 2 bis 4 mm, oder gleichwertiges Material
20. 4.Ziffer 4
    Durchführung
21. 4.1.4 Punkt eins
    Vorbereitung der Probe
22. 4.1.1.4 Punkt eins Punkt eins
    Vorbereitung der Probe ohne Zugabe des inneren Standards 1 g der Probe wird in einen 50-ml-Erlenmeyerkolben (3.5) eingewogen. Nach Zusatz von 1,00 ml 2 M Schwefelsäure (2.10) und 40,0 ml der Ethanol/Wasser-Mischung (2.13) sowie ungefähr 1 g Siedesteinchen (3.7) wird der verschlossene Kolben kräftig geschüttelt, bis eine homogene Suspension entstanden ist, mindestens jedoch 1 Minute. Zur Verbesserung der Extraktion wird der Kolben genau 5 Minuten im Wasserbad (3.1) auf 60 °C erwärmt. Danach wird der Kolben sofort unter fließendem kaltem Wasser abgekühlt und anschließend eine Stunde lang bei 5 °C aufbewahrt. Der Extrakt wird durch ein Papierfilter (3.4) filtriert. Etwa 2 ml des Filtrats werden in ein Probenfläschchen (3.6) übergeführt und bei 5 °C aufbewahrt.

    Die HPLC-Bestimmung ist innerhalb von 24 Stunden nach Herstellung der Probelösung durchzuführen.
23. 4.1.2.4 Punkt eins Punkt 2
    Vorbereitung der Probe unter Zugabe des inneren Standards

    1 g 0,1 g (a Gramm) der Probe wird auf drei Dezimalstellen genau in einen 50-ml-Erlenmeyerkolben (3.5) eingewogen. Nach Zusatz von 1,00 ml 2 M Schwefelsäure (2.10) und 30,0 ml der Ethanol/Wasser-Mischung (2.13) sowie ungefähr 1 g Siedesteinchen (3.7) und 10,00 ml der Lösung des inneren Standards (2.14) wird der verschlossene Kolben kräftig geschüttelt, bis eine homogene Suspension entstanden ist, mindestens jedoch 1 Minute. Zur Verbesserung der Extraktion wird der Kolben genau 5 Minuten im Wasserbad (3.1) auf 60 °C erwärmt. Danach wird der Kolben sofort unter fließendem kaltem Wasser abgekühlt und anschließend eine Stunde lang bei 5 °C aufbewahrt. Der Extrakt wird durch ein Papierfilter (3.4) filtriert. Etwa 2 ml des Filtrats werden in ein Probenfläschchen (3.6) übergeführt und bei 5 °C aufbewahrt.

    Die HPLC-Bestimmung ist innerhalb von 24 Stunden nach Herstellung der Probelösung durchzuführen.
24. 4.2.4 Punkt 2
    Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

    Bedingungen für die Chromatographie

    Mobile Phase: Acetonitril/Acetatpuffer (2.15.2)

    Volumenstrom der mobilen Phase: 2,0 ml/min 0,5 ml/min

    Detektionswellenlänge: 240 nm
25. 4.2.1.4 Punkt 2 Punkt eins
    Kalibrierung

    10 l jeder der 5 Standardlösungen der Konservierungsstoffe (2.17) werden chromatographiert, das Chromatogramm aufgezeichnet und die Peakhöhen ermittelt.

    Für jede Standardlösung wird das Verhältnis zwischen der Peakhöhe des zu bestimmenden Konservierungsstoffes und der des inneren Standards ermittelt. Es wird eine Kalibrierkurve gezeichnet, indem das Peakhöhenverhältnis in Abhängigkeit von der Konzentration des Konservierungsstoffes aufgetragen wird, oder es wird die Regressionsgerade berechnet. Man vergewissert sich, daß sich für die Standardlösungen eine lineare Kurve ergibt.
26. 4.2.2.4 Punkt 2 Punkt 2
    Bestimmung

    Jeweils 10 l der Probelösung (4.1.1) und einer der Standardlösungen der Konservierungsstoffe (2.17) werden chromatographiert und die Chromatogramme aufgezeichnet. Die Chromatogramme der Probe- und der Standardlösung werden verglichen. Falls das Chromatogramm der Probelösung (4.1.1) keinen Peak mit der Rententionszeit des empfohlenen inneren Standards 2-Methoxybenzoesäure zeigt, werden 10 l der Probelösung (4.1.2) chromatographiert und das Chromatogramm aufgezeichnet.

    Falls im Chromatogramm der Probelösung (4.1.1) ein störender Peak erscheint, der dieselbe Retentionszeit wie 2-Methoxybenzoesäure aufweist, ist ein anderer geeigneter innerer Standard zu wählen. Als innerer Standard kann einer der zu bestimmenden Konservierungsstoffe verwendet werden, der nicht auf dem Chromatogramm der Probelösung erscheint. Die Chromatogramme der Standardlösung und der Probelösung sollen folgende Bedingungen erfüllen:

    • –Strichaufzählung
      Peakauflösung: Die Peakauflösung soll mindestens 0,90 betragen (zur Definition der Peakauflösung siehe Abbildung 1).

• –Strichaufzählung
  Peakasymmetrie: Der Asymmetriefaktor AS soll zwischen 0,9 und 1,5 liegen (zur Definition des Asymmetriefaktors siehe Abbildung 2). Bei der Aufzeichnung des Chromatogramms zur Bestimmung der Peakasymmetrie sollte der Papiervorschub mindestens 2 cm/min betragen.

• –Strichaufzählung
  Basislinie: Die Basislinie sollte stabil sein.

1. 5.Ziffer 5
   Berechnung

   Unter Verwendung der Verhältnisse zwischen den Peakhöhen der zu bestimmenden Konservierungsstoffe und der Peakhöhe der 2-Methoxybenzoesäure (innerer Standard) wird die Konzentration der Konservierungsstoffe aus der Kalibrierkurve abgelesen bzw. aus der Gleichung für die Regressionsgerade berechnet. Der Gehalt an Benzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Sorbinsäure und Salicylsäure in Prozent (xi) der Probe wird nach folgender Formel berechnet:

1. 6.Ziffer 6
   Wiederholbarkeit (1)

   Bei einem 4-Hydroxybenzoesäuregehalt von 0,40% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,035% (m/m) voneinander abweichen.

   Bei einem Benzoesäuregehalt von 0,50% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,05% (m/m) voneinander abweichen.

   Bei einem Salicylsäuregehalt von 0,50% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,045% (m/m) voneinander abweichen.

   Bei einem Sorbinsäuregehalt von 0,60% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,035% (m/m) voneinander abweichen.
2. 7.Ziffer 7
   Bemerkungen
3. 7.1.7 Punkt eins
   Der Robustheitstest (ruggedness test) mit dieser Methode ergab, daß die für die Extraktion der Konservierungsstoffe vorgeschriebene Menge an Schwefelsäure das Ergebnis beeinflussen kann und die Einwaage der Probe in den angegebenen Grenzen erfolgen muß.
4. 7.2.7 Punkt 2
   Falls erforderlich, kann eine geeignete Vorsäule verwendet werden.
5. C.C
   BESTIMMUNG VON PROPIONSÄURE
6. 1.Ziffer eins
   Zweck und Anwendungsbereich

   Diese Methode bechreibt (Anm.: richtig: beschreibt) ein Verfahren zur Bestimmung von Propionsäure bis zu einer Höchstkonzentration von 2% (m/m) in kosmetischen Mitteln.Diese Methode bechreibt Anmerkung, richtig: beschreibt) ein Verfahren zur Bestimmung von Propionsäure bis zu einer Höchstkonzentration von 2% (m/m) in kosmetischen Mitteln.
7. 2.Ziffer 2
   Definition

   Der nach diesem Verfahren ermittelte Gehalt an Propionsäure wird in Prozent (% m/m) des Erzeugnisses angegeben.
8. 3.Ziffer 3
   Kurzbeschreibung

   Nach Extraktion der Propionsäure aus dem Erzeugnis wird die Bestimmung mittels Gaschromatographie unter Verwendung von 2-Methylpropionsäure als innerer Standard durchgeführt.
9. 4.Ziffer 4
   Reagenzien

   Alle Reagenzien müssen analysenrein sein. Wasser muß destilliert sein oder zumindest gleichwertige Reinheit aufweisen.
10. 4.1.4 Punkt eins
    Ethanol, 96% (V/V)
11. 4.2.4 Punkt 2
    Propionsäure
12. 4.3.4 Punkt 3
    2-Methylpropionsäure
13. 4.4.4 Punkt 4
    Orthophosphorsäure, 10% (m/V)
14. 4.5.4 Punkt 5
    Propionsäure-Standardlösung

    Ungefähr 1,00 g (p Gramm) Propionsäure wird genau in einen 50-ml-Meßkolben eingewogen und mit Ethanol (4.1) zur Marke aufgefüllt.
15. 4.6.4 Punkt 6
    Lösung des inneren Standards

    Ungefähr 1,00 g (e Gramm) 2-Methylpropionsäure wird genau in einen 50-ml-Meßkolben eingewogen und mit Ethanol (4.1) zur Marke aufgefüllt.
16. 5.Ziffer 5
    Geräte
17. 5.1.5 Punkt eins
    Normale Laborausstattung und
18. 5.2.5 Punkt 2
    Gaschromatograph mit Flammenionisationsdetektor
19. 5.3.5 Punkt 3
    Reagenzglas, 20 ml, mit Schliffstopfen
20. 5.4.5 Punkt 4
    Wasserbad, auf 60 °C konstant einstellbar
21. 5.5.5 Punkt 5
    10-ml-Glasspritze mit Membranfiltereinheit, 0,45 m
22. 6.Ziffer 6
    Durchführung
23. 6.1.6 Punkt eins
    Vorbereitung der Probe
24. 6.1.1.6 Punkt eins Punkt eins
    Vorbereitung der Probe ohne Zugabe des inneren Standards

    1 g der Probe wird in ein Reagenzglas mit Schliffstopfen (5.3) eingewogen. Nach Zusatz von 0,50 ml Phosphorsäure (4.4) und 9,5 ml Ethanol (4.1) wird das verschlossene Reagenzglas kräftig geschüttelt. Zur Verbesserung der Extraktion (Schmelzen der Fettphase) wird das Reagenzglas 5 Minuten im Wasserbad (5.4) auf 60 °C erwärmt. Danach wird das Reagenzglas sofort unter fließendem kaltem Wasser abgekühlt. Ein Teil des Extraktes wird durch ein Membranfilter (5.5) filtriert.

    Das Filtrat ist am selben Tag zu chromatographieren.
25. 6.1.2.6 Punkt eins Punkt 2
    Vorbereitung der Probe unter Zugabe des inneren Standards

    1 g 0,1 g der Probe wird auf drei Dezimalstellen genau in ein Reagenzglas mit Schliffstopfen (5.3) eingewogen. Nach Zusatz von 0,50 ml Phosphorsäure (4.4), 0,50 ml der Lösung des inneren Standards (4.6) und 9 ml Ethanol (4.1) wird das verschlossene Reagenzglas kräftig geschüttelt. Zur Verbesserung der Extraktion (Schmelzen der Fettphase) wird das Reagenzglas 5 Minuten im Wasserbad (5.4) auf 60 °C erwärmt. Danach wird das Reagenzglas sofort unter fließendem kaltem Wasser abgekühlt. Ein Teil des Extraktes wird durch ein Mebranfilter (5.5) filtriert.

    Das Filtrat ist am selben Tag zu chromatographieren.
26. 6.2.6 Punkt 2
    Bedingungen für die Gaschromatographie

    Folgende Betriebsbedingungen werden empfohlen:

1. 6.3.6 Punkt 3
   Chromatographie
2. 6.3.1.6 Punkt 3 Punkt eins
   Kalibrierung

   In eine Reihe von 20-ml-Meßkolben werden 0,25, 0,50, 1,00, 2,00 bzw. 4,00 ml Propionsäurelösung (4.5) pipettiert. Nach Zusatz von 1,00 ml der Lösung des inneren Standards (4.6) mittels Pipette wird mit Ethanol (4.1) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Diese Lösungen enthalten e mg/ml 2-Methylpropionsäure als inneren Standard (dh. 1 mg/ml, wenn e = 1,000) und p/4, p/2, p, 2p bzw. 4p mg/ml Propionsäure (dh. 0,25, 0,50, 1,00, 2,00 bzw. 4,00 mg/ml, wenn p =1,000).

   1 l jeder dieser Standardlösungen wird chromatographiert, das Chromatogramm aufgezeichnet und die Peakflächen ermittelt.

   Jede Lösung wird dreimal chromatographiert und der Mittelwert für das Peakflächenverhältnis berechnet.

   Es wird eine Kalibrierkurve gezeichnet, indem das Verhältnis der Masse von Propionsäure zu 2-Methylpropionsäure als Abszisse und das Verhältnis der entsprechenden Peakfläche als Ordinate aufgetragen werden, oder es wird die Regressionsgerade berechnet.
3. 6.3.2.6 Punkt 3 Punkt 2
   Bestimmung

   Jeweils 1 l der Probelösung (6.1.1) und einer der Standardlösungen (6.3.1) werden chromatographiert und die Chromatogramme aufgezeichnet.

   Die Chromatogramme der Probe- und der Standardlösungen werden verglichen. Falls das Chromatogramm der Probelösung einen Peak mit etwa der gleichen Retentionszeit wie 2-Methylpropionsäure aufweist, ist ein anderer innerer Standard zu verwenden. Wenn keine Interferenz beobachtet wird, wird 1 l der Probelösung (6.1.2) chromatographiert, das Chromatogramm aufgezeichnet und die Peakflächen der Propionsäure und des inneren Standards ermittelt.

   Die Probelösung wird dreimal chromatographiert und der Mittelwert für das Peakflächenverhältnis berechnet.
4. 7.Ziffer 7
   Berechnung
5. 7.1.7 Punkt eins
   Aus der Kalibrierkurve (6.3.1) wird das Verhältnis der Masse (K) abgelesen bzw. aus der Gleichung für die Regressionsgerade berechnet, das dem gemäß 6.3.2 berechneten Peakflächenverhältnis entspricht.
6. 7.2.7 Punkt 2
   Der Propionsäuregehalt in Prozent (x) der Probe wird unter Verwendung des ermittelten Masseverhältnisses nach folgender Formel berechnet:

1. 8.Ziffer 8
   Wiederholbarkeit (1)

   Bei einem Propionsäuregehalt von 2% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,12% (m/m) voneinander abweichen.

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(1) ISO 5725.