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Anlage 37 NACHWEIS UND BESTIMMUNG VON HYDROCHINON, HYDROCHINONMONOMETHYLETHER, HYDROCHINONMONOETHYLETHER UND HYDROCHINONMONOBENZYLETHER IN KOSMETISCHEN MITTELN

1. A.A
   NACHWEIS
2. 1.Ziffer eins
   Zweck und Anwendungsbereich

   Diese Methode beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Hydrochinon, Hydrochinonmonomethylether, Hydrochinonmonoethylether und Hydrochinonmonobenzylether (Monobenzon) in kosmetischen Mitteln zur Aufhellung der Haut (Hautbleichmittel)
3. 2.Ziffer 2
   Kurzbeschreibung

   Hydrochinon und seine Ether werden mittels Dünnschichtchromatographie (DC) nachgewiesen.
4. 3.Ziffer 3
   Reagenzien

   Alle Reagenzien müssen analysenrein sein.
5. 3.1.3 Punkt eins
   Ethanol, 96% (V/V)
6. 3.2.3 Punkt 2
   Chloroform

   Warnung:

   Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch Einatmen und durch Verschlucken. Reizt die Haut. Irreversibler Schaden möglich.

   Hinweis:

   Chloroform kann ohne Beeinflussung der Trennleistung des chromatographischen Systems durch Dichlormethan ersetzt werden.
7. 3.3.3 Punkt 3
   Diethylether
8. 3.4.3 Punkt 4
   Fließmittel: Chloroform/Diethylether, 66 + 33 (V + V)Fließmittel: Chloroform/Diethylether, 66 + 33 (römisch fünf + römisch fünf)
9. 3.5.3 Punkt 5
   Ammoniak-Lösung, 25% (m/m)

              (d = 0,91 g/ml)

1. 3.6.3 Punkt 6
   Ascorbinsäure
2. 3.7.3 Punkt 7
   Hydrochinon
3. 3.8.3 Punkt 8
   Hydrochinonmonomethylether
4. 3.9.3 Punkt 9
   Hydrochinonmonoethylether
5. 3.10.3 Punkt 10
   Hydrochinonmonobenzylether (Monobenzon)
6. 3.11.3 Punkt 11
   Vergleichslösungen

   Die Vergleichslösungen sind frisch herzustellen; sie sind einen Tag lang haltbar.
7. 3.11.1.3 Punkt 11 Punkt eins
   0,05 g Hydrochinon (3.7) werden in ein graduiertes 10-ml-Reagenzglas eingewogen. Nach Zusatz von 0,25 g Ascorbinsäure (3.6) und 5 ml Ethanol (3.1) wird die Mischung mit Ammoniaklösung (3.5) auf einen pH-Wert von 10 eingestellt. Anschließend wird die Mischung mit Ethanol (3.1) zu 10 ml aufgefüllt.
8. 3.11.2.3 Punkt 11 Punkt 2
   0,05 g Hydrochinonmonomethylether (3.8) werden in ein graduiertes 10-ml-Reagenzglas eingewogen. Nach Zusatz von 0,25 g Ascorbinsäure (3.6) und 5 ml Ethanol (3.1) wird die Mischung mit Ammoniaklösung (3.5) auf einen pH-Wert von 10 eingestellt. Anschließend wird die Mischung mit Ethanol (3.1) zu 10 ml aufgefüllt.
9. 3.11.3.3 Punkt 11 Punkt 3
   0,05 g Hydrochinonmonoethylether (3.9) werden in ein graduiertes 10-ml-Reagenzglas eingewogen. Nach Zusatz von 0,25 g Ascorbinsäure (3.6) und 5 ml Ethanol (3.1) wird die Mischung mit Ammoniaklösung (3.5) auf einen pH-Wert von 10 eingestellt. Anschließend wird die Mischung mit Ethanol (3.1) zu 10 ml aufgefüllt.
10. 3.11.4.3 Punkt 11 Punkt 4
    0,05 g Hydrochinonmonobenzylether (3.10) werden in ein graduiertes 10-ml-Reagenzglas eingewogen. Nach Zusatz von 0,25 g Ascorbinsäure (3.6) und 5 ml Ethanol (3.1) wird die Mischung mit Ammoniaklösung (3.5) auf einen pH-Wert von 10 eingestellt. Anschließend wird die Mischung mit Ethanol (3.1) zu 10 ml aufgefüllt.
11. 3.12.3 Punkt 12
    Silbernitrat
12. 3.13.3 Punkt 13
    12-Molybdatophosphorsäure
13. 3.14.3 Punkt 14
    Kaliumhexacyanoferrat (III)Kaliumhexacyanoferrat (römisch drei)
14. 3.15.3 Punkt 15
    Eisen (III)-chlorid-hexahydratEisen (römisch drei)-chlorid-hexahydrat
15. 3.16.3 Punkt 16
    Sprühreagenzien
16. 3.16.1.3 Punkt 16 Punkt eins
    Einer 5%igen (m/V) wäßrigen Lösung von Silbernitrat (3.12) wird Ammoniak-Lösung (3.5) hinzugefügt, bis sich der gebildete Niederschlag wieder auflöst.

    Warnhinweis:

    Bei längerem Stehen bilden sich explosive Verbindungen. Die Lösung ist daher nach Gebrauch zu verwerfen.
17. 3.16.2.3 Punkt 16 Punkt 2
    10%ige (m/V) Lösung von 12-Molybdatophosphorsäure (3.13) in Ethanol (3.1).
18. 3.16.3.3 Punkt 16 Punkt 3
    Lösung 1: 1%ige (m/V) wäßrige Lösung von Kaliumhexacyanoferrat (III) (3.14)Lösung 1: 1%ige (m/V) wäßrige Lösung von Kaliumhexacyanoferrat (römisch drei) (3.14)

    Lösung 2: 2%ige (m/V) wäßrige Lösung von Eisen (III)-chlorid (3.15)Lösung 2: 2%ige (m/V) wäßrige Lösung von Eisen (römisch drei)-chlorid (3.15)

    Unmittelbar vor Gebrauch werden gleiche Volumina der Lösungen 1 und 2 gemischt.
19. 4.Ziffer 4
    Geräte

    Normale Laborausstattung und
20. 4.1.4 Punkt eins
    Übliche Ausrüstung zur Dünnschichtchromatographie
21. 4.2.4 Punkt 2
    DC-Fertigplatten (200 mm x 200 mm)

1. 4.3.4 Punkt 3
   Ultraschallbad
2. 4.4.4 Punkt 4
   Zentrifuge
3. 4.5.4 Punkt 5
   UV-Lampe, Wellenlänge 254 nm
4. 5.Ziffer 5
   Durchführung
5. 5.1.5 Punkt eins
   Vorbereitung der Probe

   3,0 g der Probe werden in ein graduiertes 10-ml-Reagenzglas eingewogen. Nach Zusatz von 0,25 g Ascorbinsäure (3.6) und 5 ml Ethanol (3.1) wird die Mischung mit Ammoniaklösung (3.5) auf einen pH-Wert von 10 eingestellt. Anschließend wird die Mischung mit Ethanol (3.1) zu 10 ml aufgefüllt. Das Reagenzglas wird verschlossen und der Inhalt im Ultraschallbad 10 min homogenisiert. Die Mischung wird durch ein Papierfilter filtriert oder bei 3 000 U/min zentrifugiert.
6. 5.2.5 Punkt 2
   Dünnschichtchromatographie
7. 5.2.1.5 Punkt 2 Punkt eins
   Die Chromatographiekammer wird mit dem Fließmittel (3.4) gesättigt.
8. 5.2.2.5 Punkt 2 Punkt 2
   Je 2 l der Vergleichslösungen (3.11) und 2 l der Probelösung (5.1) werden auf die Dünnschichtplatte aufgetragen. Die Dünnschichtplatte wird bei Raumtemperatur und unter Lichtschutz bis zu einer Höhe von 150 mm entwickelt.
9. 5.2.3.5 Punkt 2 Punkt 3
   Die Dünnschichtplatte wird der Kammer entnommen und bei Raumtemperatur aufbewahrt, bis das Fließmittel verdunstet ist.
10. 5.3.5 Punkt 3
    Detektion
11. 5.3.1.5 Punkt 3 Punkt eins
    Die Dünnschichtplatte wird im ultravioletten Licht der Wellenlänge 254 nm betrachtet; die Flecke werden markiert.
12. 5.3.2.5 Punkt 3 Punkt 2
    Anschließend wird die Dünnschichtplatte besprüht entweder mit

    • –Strichaufzählung
      dem Silbernitrat-Reagenz (3.16.1) oder
    • –Strichaufzählung
      dem 12-Molybdatophosphorsäure-Reagenz (3.16.2) und auf etwa 120 °C erhitzt oder
    • –Strichaufzählung
      der Mischung aus Kaliumhexacyanoferrat(III)-Lösung und Eisen(III)-chlorid-Lösung (3.16.3).der Mischung aus Kaliumhexacyanoferrat(römisch drei)-Lösung und Eisen(römisch drei)-chlorid-Lösung (3.16.3).
13. 6.Ziffer 6
    Auswertung

    Der Rf-Wert wird für jeden Fleck berechnet.

    Die für die Probelösung erhaltenen Flecke werden mit denen der Vergleichslösungen im Hinblick auf ihre Rf-Werte, die Farbe der Flecke im UV-Licht und die Farben der Flecke nach Sichtbarmachung mit dem Sprühreagenz verglichen. Man führt die im folgenden Abschnitt B beschriebene HPLC durch und vergleicht die Retentionszeiten der Probenpeaks mit denen der Vergleichslösungen.

    Der Nachweis von Hydrochinon und seiner Ether wird durch Kombination der Ergebnisse der DC und der HPLC geführt.
14. 7.Ziffer 7
    Bemerkungen

    Unter den angegebenen Bedingungen wurden folgende Rf-Werte ermittelt:

1. B.B
   BESTIMMUNG
2. 1.Ziffer eins
   Zweck und Anwendungsbereich

   Diese Methode beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung von Hydrochinon, Hydrochinonmonomethylether, Hydrochinonmonoethylether und Hydrochinonmonobenzylether (Monobenzon) in kosmetischen Mitteln zur Aufhellung der Haut (Hautbleichmittel).
3. 2.Ziffer 2
   Kurzbeschreibung

   Die Probe wird mit einer Wasser/Methanol-Mischung extrahiert, wobei durch schwaches Erwärmen das Schmelzen etwaig vorhandener Fette gewährleistet wird. Die Bestimmung der Analyten im Extrakt erfolgt durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit reverser Phase und UV-Detektion.
4. 3.Ziffer 3
   Reagenzien
5. 3.1.3 Punkt eins
   Alle Reagenzien müssen analysenrein sein. Wasser muß destilliert sein oder zumindest gleichwertige Reinheit aufweisen.
6. 3.2.3 Punkt 2
   Methanol
7. 3.3.3 Punkt 3
   Hydrochinon
8. 3.4.3 Punkt 4
   Hydrochinonmonomethylether
9. 3.5.3 Punkt 5
   Hydrochinonmonoethylether
10. 3.6.3 Punkt 6
    Hydrochinonmonobenzylether (Monobenzon)
11. 3.7.3 Punkt 7
    Tetrahydrofuran für die HPLC
12. 3.8.3 Punkt 8
    Wasser/Methanol-Mischung 1 + 1 (V + V): 1 Volumenteil Wasser und 1 Volumenteil Methanol (3.2) werden gemischt.Wasser/Methanol-Mischung 1 + 1 (römisch fünf + römisch fünf): 1 Volumenteil Wasser und 1 Volumenteil Methanol (3.2) werden gemischt.
13. 3.9.3 Punkt 9
    Mobile Phase: Tetrahydrofuran/Wasser-Mischung 45 + 55 (V + V): 45 Volumenteile Tetrahydrofuran (3.7) und 55 Volumenteile Wasser werden gemischt.Mobile Phase: Tetrahydrofuran/Wasser-Mischung 45 + 55 (römisch fünf + römisch fünf): 45 Volumenteile Tetrahydrofuran (3.7) und 55 Volumenteile Wasser werden gemischt.
14. 3.10.3 Punkt 10
    Standardlösung

    0,06 g Hydrochinon (3.3), 0,08 g Hydrochinonmonomethylether (3.4), 0,10 g Hydrochinonmonoethylether (3.5) und 0,12 g Hydrochinonmonobenzylether (3.6) werden in einen 50-ml-Meßkolben genau eingewogen, in Methanol (3.2) gelöst und anschließend mit Methanol zur Marke aufgefüllt. 10,00 ml dieser Stammlösung werden mit der Wasser/Methanol-Mischung (3.8) zu 50,00 ml verdünnt.

    Die Lösungen sind frisch herzustellen.
15. 4.Ziffer 4
    Geräte

    Normale Laborausstattung und
16. 4.1.4 Punkt eins
    Wasserbad, auf 60 °C konstant einstellbar
17. 4.2.4 Punkt 2
    Hochleistungsflüssigkeitschromatograph mit UV-Detektor mit variabler Wellenlänge und mit 10 l-Probenschleife
18. 4.3.4 Punkt 3
    Analytische Trennsäule

    Material: Edelstahl

    Länge: 25 cm

    Innendurchmesser: 4,6 mm

    Aktiver Festkörper: Zorbax Phenyl (6 m) oder gleichwertiges Erzeugnis (mit Phenylalkylgruppen modifiziertes Kieselgel und end-capped mit Trimethylchlorsilan)

    Falls eine Vorsäule verwendet wird, muß sie die gleichen Eigenschaften wie die Trennsäule besitzen.
19. 4.4.4 Punkt 4
    Papierfilter, Durchmesser 90 mm (Schleicher und Schüll, Weißband Nr. 5892, oder gleichwertiges Erzeugnis)
20. 5.Ziffer 5
    Durchführung
21. 5.1.5 Punkt eins
    Vorbereitung der Probe

    1 g 0,1 g (a Gramm) der Probe wird auf drei Dezimalstellen genau in einen 50-ml-Meßkolben eingewogen. Nach Zusatz von 25 ml der Wasser/Methanol-Mischung (3.8) wird der verschlossene Kolben mindestens 1 Minute kräftig geschüttelt, bis eine homogene Suspension erhalten wird. Zur Verbesserung der Extraktion wird der Kolben im Wasserbad (4.1) auf 60 °C erwärmt. Nach dem Abkühlen wird mit der Wasser/Methanol-Mischung (3.8) zur Marke aufgefüllt. Die Mischung wird durch ein Papierfilter (4.4) filtriert. Die HPLC-Bestimmung ist innerhalb von 24 Stunden nach Herstellung der Probelösung durchzuführen.
22. 5.2.5 Punkt 2
    Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
23. 5.2.1.5 Punkt 2 Punkt eins
    Bedingungen für die Chromatographie

    Volumenstrom der mobilen Phase (3.9): 1,0 ml/min

    Detektionswellenlänge: 295 nm
24. 5.2.2.5 Punkt 2 Punkt 2
    10 l der Probelösung (5.1) werden chromatographiert, das Chromatogramm aufgezeichnet und die Peakflächen ermittelt.

    Die Kalibrierung wird, wie unter 5.2.3 beschrieben, durchgeführt.

    Die Chromatogramme der Probe- und der Standardlösung werden verglichen.

    Unter Verwendung der Peakflächen und des gemäß Abschnitt 5.2.3 ermittelten Responsefaktors (RF) wird der Gehalt der Analyten in der Probelösung berechnet.
25. 5.2.3.5 Punkt 2 Punkt 3
    Kalibrierung

    10 l der Standardlösung (3.10) werden chromatographiert, das Chromatogramm aufgezeichnet und die Peakflächen ermittelt.

    Die Wiederholbarkeit des Meßsignals wird durch wiederholtes Chromatographieren überprüft.

    Der Responsefaktor RFi,wird wie folgt berechnet:

• –Strichaufzählung
  Peakauflösung: Die Peakauflösung soll mindestens 0,90 betragen (zur Definition der Peakauflösung siehe Abbildung 1).

• –Strichaufzählung
  Peakasymmetrie: Der Asymmetriefaktor AS soll zwischen 0,9 und 1,5 liegen (zur Definition des Asymmetriefaktors siehe Abbildung 2). Bei der Aufzeichnung des Chromatogramms zur Bestimmung der Peakasymmetrie sollte der Papiervorschub mindestens 2 cm/min betragen.

• –Strichaufzählung
  Basislinie: Die Basislinie sollte stabil sein.

1. 6.Ziffer 6
   Berechnung

   Der Gehalt des/der Analyten in Prozent (xi) der Probe wird anhand der Peakflächen nach folgender Formel berechnet:

1. 7.Ziffer 7
   Wiederholbarkeit (1)
2. 7.1.7 Punkt eins
   Bei einem Hydrochinongehalt von 2,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,13% (m/m) voneinander abweichen.
3. 7.2.7 Punkt 2
   Bei einem Hydrochinonmonomethylethergehalt von 1,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,1% (m/m) voneinander abweichen.
4. 7.3.7 Punkt 3
   Bei einem Hydrochinonmonoethylethergehalt von 1,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,11% (m/m) voneinander abweichen.
5. 7.4.7 Punkt 4
   Bei einem Hydrochinonmonobenzylethergehalt von 1,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,11% (m/m) voneinander abweichen.
6. 8.Ziffer 8
   Vergleichbarkeit (1)
7. 8.1.8 Punkt eins
   Bei einem Hydrochinongehalt von 2,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe unter Vergleichsbedingungen (verschiedene Laboratorien, verschiedene Bearbeiter, verschiedene Geräteausrüstung) durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,37% (m/m) voneinander abweichen.
8. 8.2.8 Punkt 2
   Bei einem Hydrochinonmonomethylethergehalt von 1,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe unter Vergleichsbedingungen (verschiedene Laboratorien, verschiedene Bearbeiter, verschiedene Geräteausrüstung) durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,21% (m/m) voneinander abweichen.
9. 8.3.8 Punkt 3
   Bei einem Hydrochinonmonoethylethergehalt von 1,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe unter Vergleichsbedingungen (verschiedene Laboratorien, verschiedene Bearbeiter, verschiedene Geräteausrüstung) durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,19% (m/m) voneinander abweichen.
10. 8.4.8 Punkt 4
    Bei einem Hydrochinonmonobenzylethergehalt von 1,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe unter Vergleichsbedingungen (verschiedene Laboratorien, verschiedene Bearbeiter, verschiedene Geräteausrüstung) durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,11% (m/m) voneinander abweichen.
11. 9.Ziffer 9
    Bemerkungen
12. 9.1.9 Punkt eins
    Wenn ein wesentlich höherer Hydrochinongehalt als 2% (m/m) ermittelt wird und eine genaue Gehaltsbestimmung erforderlich ist, sollte die Probelösung (5.1) auf einen ähnlichen Gehalt verdünnt werden, wie er sich bei einer 2% Hydrochinon enthaltenden Probe ergeben würde, und die Bestimmung ist zu wiederholen.

    (Bei hohen Hydrochinongehalten kann die Absorption außerhalb des linearen Bereiches des Detektors liegen.)
13. 9.2.9 Punkt 2
    Störeinflüsse

    Die beschriebene Methode ermöglicht die Bestimmung von Hydrochinon und seinen Ethern in einem einzigen isokratischen Lauf. Die Verwendung einer Phenylsäule gewährleistet eine hinreichende Retention für Hydrochinon, was bei Benutzung einer C 18-Säule mit der beschriebenen mobilen Phase nicht garantiert werden kann.

    Diese Methode unterliegt jedoch möglicherweise den Störeinflüssen durch eine Reihe von p-Hydroxybenzoesäureestern (Parabene). In diesen Fällen ist die Bestimmung unter Verwendung eines anderen Trennsystems (stationäre und mobile Phase) zu wiederholen. Geeignete Methoden sind (siehe die in den Fußnoten 1 und 2 angegebene Literatur):

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1. (Absatz eins,1) ISO 5725
2. (Absatz 2,2) M. Herpol-Borremans und M. O. Masse, Indentification et dosage de l'hydroquinone et ses ethers methylique et benzylique dans les produits cosmethiques pour blanchir la peau, Int. J. Cosmet. Sci 8 – 203-214 (1986).
3. (Absatz 3,3) J. Firth und I. Rix, Determination of Hydroquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, S. 129.3) J. Firth und römisch eins. Rix, Determination of Hydroquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, S. 129.